天然产物筛到靶点就结束了？对于共价分子，从靶点，到位点，让作用机制再向前一步

导语天然产物深入研究不能止步于靶点发现。对于共价分子而言靶点鉴定不是终点结合位点解析才是深入机制研究的关键一步。摘要靶点筛选解决的是“谁是靶点”而对于共价分子而言还需要进一步明确“在哪里发生共价结合”。因此在完成靶点鉴定后针对具有共价作用特征的天然产物或小分子进一步解析其共价结合位点更加深入地揭示分子与靶蛋白之间的作用模式。天然产物靶点研究找到“结合了谁”只是第一步天然产物与靶蛋白之间的相互作用既可能表现为可逆的非共价结合也可能通过亲电反应基团与蛋白特定氨基酸残基形成稳定的共价加合物。对于具有潜在共价反应活性的天然产物而言如果能够进一步明确其与靶蛋白形成共价结合的具体氨基酸位点不仅可以确认直接作用关系还能够进一步解析其结合模式与作用机制。因此在完成天然产物靶点筛选后进一步利用LC-MS/MS进行共价结合位点鉴定可以将研究从“靶点是谁”深入到“究竟结合在哪里”。技术原理LC-MS/MS如何定位共价结合位点共价结合鉴定的核心原理是通过识别修饰所引起的质量变化并结合串联质谱MS/MS精确定位修饰位点。当小分子药物或化学探针与蛋白中的亲核残基如半胱氨酸、赖氨酸或N-末端形成共价键时修饰会导致目标肽段或蛋白整体分子质量发生特征性偏移。LC-MS/MS不仅能够告诉我们“天然产物是否与该靶蛋白共价结合”还能够进一步回答“天然产物与这个蛋白的哪个氨基酸发生了共价结合”。本文汇总4项相关研究一起看看天然产物与靶点的共价结合位点如何展开研究案例1天然产物 Auxarconjugatin B共价靶向 SCAMP2 治疗胶质母细胞瘤天然产物Auxarconjugatin BAUX-B靶蛋白分泌载体膜蛋白 2SCAMP2结合位点赖氨酸Lys1302026年2月中国医学科学院药物研究所研究团队在Acta Pharmaceutica Sinica BIF14.6发表题为“Targeting SCAMP2 by a natural product auxarconjugatin B for glioblastoma therapy via restoring aspartate metabolic flux”的研究论文。研究者首先设计炔基标记的AUX-B探针并利用ABPP技术筛选其作用靶点为SCAMP2进一步通过LC-MS/MS鉴定AUX-B与SCAMP2的共价结合位点是Lys130K130。深入的机制研究表明AUX-B与SCAMP2共价结合后显著破坏SCAMP2与天冬氨酸转运蛋白SLC1A3和SLC25A12的相互作用导致细胞内天冬氨酸水平下降从而抑制胶质母细胞瘤增殖。案例2去氢木香内酯共价靶向NLRP3缓解炎症天然产物去氢木香内酯DCL靶蛋白NOD样受体家族含pyrin结构域蛋白3NLRP3结合位点半胱氨酸Cys2802025年9月南京中医药大学研究团队在MedCommIF14.4发表题为“Dehydrocostus Lactone Effectively Alleviates Inflammatory Diseases by Covalently and Irreversibly Targeting NLRP3”的研究论文。研究者首先整合ZINC、TCMSP及内部天然产物库开展虚拟筛选和共价对接从中筛选出具有潜在NLRP3共价结合能力的天然产物去氢木香内酯DCL。随后通过细胞活性实验发现DCL可显著抑制NLRP3炎性小体活化及IL-1β释放。进一步利用LC-MS/MS解析DCL修饰的NLRP3肽段确定其通过Michael加成反应与Cys280形成共价键并经C280A突变得到验证。机制研究表明DCL共价修饰NLRP3 Cys280后破坏NLRP3与NEK7的相互作用进而抑制NLRP3炎性小体激活。案例3旋覆花中的内酯类天然产物共价靶向PBK治疗神经炎症天然产物1-O-acetyl-4R,6S-britannilactone AB靶蛋白PDZ结合激酶PBK结合位点半胱氨酸Cys702025年7月天津中医药大学研究团队在PNASIF9.4发表题为“Targeting PBK with small-molecule 1-O-acetyl-4R,6S-britannilactone for the treatment of neuroinflammation”的研究论文。研究者首先利用20K人类蛋白质组芯片筛选AB的潜在作用靶点鉴定获得PBK并通过DARTS/CETSAWB、MST等技术验证二者的直接结合。进一步利用LC-MS/MS鉴定共价结合位点发现AB通过Cys70与PBK形成共价结合。机制研究表明AB共价修饰PBK Cys70后调控PBK/TIPE2信号轴抑制TIPE2 S3位点磷酸化及泛素化降解从而发挥抗神经炎症作用。案例4醉茄素A共价靶向KPNB1抑制肿瘤生长天然产物醉茄素A WA靶蛋白核收受蛋白亚基β-1KPNB1结合位点半胱氨酸Cys1582025年5月四川大学研究团队在PNASIF9.4发表题为“VCP’s nuclear journey: Initiated by interacting with KPNB1 to repair DNA damage”的研究论文。研究者首先通过DARTS技术从间变性甲状腺癌细胞中筛选出天然产物醉茄内酯AWA的潜在作用靶点KPNB1并结合CETSA、DARTS和MST等技术进一步验证二者的直接结合。随后通过片段定位与LC-MS/MS质谱分析发现KPNB1的Cys158和Cys228可能为WA的共价结合位点并经突变实验进一步确认Cys158是关键结合残基。机制研究表明WA通过与KPNB1 Cys158形成共价结合破坏KPNB1与VCP的相互作用抑制VCP核转位及DNA损伤修复进而发挥抗肿瘤作用。达吉特专家评述天然产物靶点研究并不应止步于“筛选验证靶蛋白”。对于具有潜在共价反应活性的天然产物进一步明确其与靶蛋白形成共价结合的具体氨基酸位点可以为直接靶点关系提供更深入的分子证据同时帮助解析天然产物的结合模式、关键结构基础及作用机制。因此一条更加完整的研究证据链可以概括为其中LC-MS/MS共价结合位点鉴定正是连接“靶点发现”和“机制解析”的重要环节。对于含有亲电反应基团、具有潜在共价作用特征的天然产物与其只回答“它结合了谁”不妨进一步回答“它究竟结合在哪里”。达吉特的共价结合位点研究服务靶点筛选不是终点结合位点解析让药靶研究更进一步。针对具有潜在共价结合特征的天然产物达吉特通过LC-MS/MS开展共价结合位点鉴定定位天然产物修饰的关键氨基酸残基为“靶点鉴定—结合位点—作用机制”研究提供完整的技术支持。相关文献Shang C, Li W, Pu Q, et al. Targeting SCAMP2 by a natural product auxarconjugatin B for glioblastoma therapy via restoring aspartate metabolic flux. Acta Pharm Sin B. 2026;16(5):3090-3108. doi:10.1016/j.apsb.2026.02.018Lv Q, Zhang Y, Wang J, et al. Dehydrocostus Lactone Effectively Alleviates Inflammatory Diseases by Covalently and Irreversibly Targeting NLRP3. MedComm (2020). 2025;6(9):e70367. Published 2025 Sep 3. doi:10.1002/mco2.70367Zhang J, Zhang HL, Xu XR, et al. Targeting PBK with small-molecule 1-O-acetyl-4R,6S-britannilactone for the treatment of neuroinflammation. Proc Natl Acad Sci U S A. 2025;122(29):e2502593122. doi:10.1073/pnas.2502593122Xing Z, Cai X, He T, et al. VCPs nuclear journey: Initiated by interacting with KPNB1 to repair DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A. 2025;122(19):e2416045122. doi:10.1073/pnas.2416045122